Xác định hàm lượng Auramin O (Vàng O) trong sầu riêng bằng hệ thống LC/MS/MS dựa theo tiêu chuẩn China BJS 202204

Nhóm tác giả

Phạm Quốc Trung, Trần Minh Trung, Nguyễn Việt Anh và Hồ Tuấn Đạt
Trung tâm ứng dụng tiên tiến Indochina (COE), REDSTAR-CMS

Narong Lenghor, Boonraksa Srisawang và Lay Peng Tan
Agilent Technologies Singapore (Sales) Pte Ltd

Tóm tắt

Tài liệu này trình bày chi tiết phương pháp xác định Auramin O (Vàng O) trong nền sầu riêng bằng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực (LC/TQ) Agilent 6495D, dựa trên tiêu chuẩn China BJS 202204. Hệ thống Agilent 6495D LC/TQ chứng minh hiệu năng ưu việt với độ lặp lại cao và độ nhạy vượt trội, cho phép phát hiện Vàng O ở mức cực kỳ thấp, đạt ngưỡng phần nghìn tỷ (ppt). Phương pháp này thể hiện độ chọn lọc xuất sắc, độ nhạy và khả năng tuyến tính ổn định (R² > 0.999) trong khoảng nồng độ từ 0.05 đến 5.0 µg/L. Độ chính xác được kiểm chứng tại các mức nồng độ 0.5 và 2.5 µg/kg, với hiệu suất thu hồi từ 73–104% và ảnh hưởng từ nền mẫu gần như không đáng kể. Giá trị RSD nằm trong khoảng từ 1 đến 6%, đáp ứng đầy đủ các yêu cầu của Phụ lục F của Hiệp hội các nhà hóa học phân tích (AOAC).

Giới thiệu

Auramine O (Vàng O) là một loại thuốc nhuộm tổng hợp thuộc nhóm diarylmethane, nổi bật với màu vàng sáng đặc trưng và chi phí sản xuất thấp. Dù có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, Vàng O đã được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp vào Nhóm 2B, tức là chất có nguy cơ gây ung thư cho con người, dựa trên các bằng chứng về khả năng đột biến và gây ung thư ¹. Do đó, việc sử dụng Vàng O trong thực phẩm bị nghiêm cấm hoàn toàn. Tuy nhiên, gần đây, những lo ngại đã gia tăng về việc sử dụng bất hợp pháp Vàng O để làm tăng tính bắt mắt của các sản phẩm nông nghiệp, điển hình là sầu riêng – một loại trái cây có giá trị xuất khẩu cao tại khu vực Đông Nam Á ².

Tại Trung Quốc, quốc gia đứng đầu thế giới về nhập khẩu sầu riêng, các quy định an toàn thực phẩm nghiêm cấm rõ ràng việc sử dụng Vàng O trong bất kỳ loại thực phẩm nào. Điều này được thể hiện trong Tiêu chuẩn An toàn Thực phẩm Quốc gia GB 2760-2024, quy định chỉ các phụ gia thực phẩm nằm trong danh mục được phê duyệt mới được phép sử dụng. Vì Vàng O không nằm trong danh mục này, chất này bị chính thức xếp vào danh sách cấm hoàn toàn ³. Các cơ quan chức năng của Trung Quốc, bao gồm Ủy ban Y tế Quốc gia (NHC) và Tổng cục Hải quan Trung Quốc (GACC), đã tăng cường các biện pháp giám sát tại biên giới cũng như kiểm tra thường xuyên để đảm bảo tuân thủ quy định ⁴. Điều này làm nổi bật nhu cầu cấp thiết về việc phát triển các phương pháp phát hiện nhanh, nhạy và đáng tin cậy nhằm bảo vệ người tiêu dùng cũng như duy trì các tiêu chuẩn thương mại quốc tế.

Việc kiểm nghiệm Vàng O trong sầu riêng gặp nhiều khó khăn do tính phức tạp của nền mẫu. Phần cơm (thịt) quả chứa hàm lượng cao lipid, đường và các hợp chất bay hơi chứa lưu huỳnh, trong khi phần vỏ lại chứa lignin, cellulose, axit phenolic, flavonoid, glycosidic phenolics, coumarin, triterpen và polysaccharide. Những thành phần này có thể gây nhiễu nền nghiêm trọng, làm giảm hiệu quả chiết xuất và gây ra hiện tượng ức chế ion trong quá trình phân tích. Ngoài ra, Vàng O còn có khả năng liên kết chặt với các sắc tố tự nhiên và hợp chất hữu cơ khác, khiến việc làm sạch mẫu trở nên phức tạp hơn và làm ảnh hưởng đến độ chính xác khi định lượng. Do đó, các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm an toàn thực phẩm cần phát triển các phương pháp phân tích đạt độ nhạy, độ chọn lọc cao cũng như đảm bảo độ bền và hiệu suất để đáp ứng yêu cầu giám sát theo quy định.

Trong bối cảnh này, phương pháp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ ba tứ cực (LC/MS/MS) được đánh giá là tối ưu để phân tích BY2 nhờ khả năng đặc hiệu vượt trội, giới hạn phát hiện thấp và khả năng giảm thiểu hiệu quả hiện tượng nhiễu nền ⁵.

Tài liệu này giới thiệu về hiệu suất phân tích của hệ thống Agilent 6495D LC/TQ trong việc phát hiện chất Vàng O trong cả vỏ và cơm sầu riêng, dựa trên phương pháp BJ 202204 của Trung Quốc. Nội dung tài liệu bao gồm quy trình chuẩn bị mẫu được tối ưu hóa, các thông số tách sắc ký và thiết lập khối phổ, nhằm đảm bảo kết quả phát hiện nhanh chóng, nhạy và đáng tin cậy. Điều này hỗ trợ các phòng thí nghiệm đáp ứng các tiêu chuẩn hiện hành của Trung Quốc liên quan đến Vàng O.

Thực nghiệm và hóa chất

Chất chuẩn và hóa chất

Chất chuẩn phân tích Vàng O (dạng rắn) được mua từ LGC (mã sản phẩm DRE-C16971353). Chất chuẩn được bảo quản ở -18 °C trong tủ đông theo khuyến cáo của nhà sản xuất.

Tất cả hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này đều đạt cấp độ phân tích (analytical grade) hoặc cao hơn. Natri sulfat khan (Na₂SO₄, Merck, 1066491000) được sử dụng để loại bỏ độ ẩm. Quá trình làm sạch mẫu sử dụng hỗn hợp chiết pha rắn phân tán (dSPE) chứa PSA (50 mg), C18 (50 mg) và MgSO₄ (150 mg) trong lọ 2 mL (mã sản phẩm: 5982-5122). Axit formic (99%, Merck, 8222541001) và Acetonitrile, cấp độ HPLC – chạy gradient (Merck, 1.00030.4000) được sử dụng để chiết mẫu. Đối với pha động, Acetonitrile (Merck, 1000294000), Amoni acetate (Merck, 5330040050), Axit formic (Merck, 5330020050) và nước siêu tinh khiết (Merck, 1.15333.2500) đạt chuẩn LC-MS đã được sử dụng.

Thiết bị

Quá trình tách sắc ký được thực hiện trên hệ thống Agilent 1290 Infinity III LC, tích hợp sẵn bộ khử khí, bộ tiêm mẫu tự động có khả năng kiểm soát nhiệt độ, và buồng cột duy trì ổn định nhiệt độ. Sử dụng cột sắc ký Agilent ZORBAX RRHD Eclipse XDB-C18 (kích thước 2.1 x 50mm, 1.8µm) cùng cột bảo vệ UHPLC tương thích để thực hiện quá trình phân tách. Pha động bao gồm nước chứa 5 mM Amoni acetate kết hợp 0.1% Axit formic (A) và Acetonitrile (B), với tốc độ dòng 0.3 mL/phút và thể tích tiêm 2 µL, vận hành dựa trên chương trình gradient được trình bày trong Bảng 1.

Hệ thống 6495D LC/TQ được trang bị nguồn ion hóa phun sương điện tử Agilent Jet Stream (AJS), vận hành ở chế độ ion hóa dương và chế độ dynamic MRM. Các điều kiện nguồn ion hóa và thông số MRM được tóm tắt trong Bảng 1. Tất cả dữ liệu thu nhận và xử lý đều được thực hiện bằng phần mềm Agilent MassHunter phiên bản 12.

Table 1. Thông số trên Agilent 6495D LC/TQ

Thông số	Giá trị
LC
HPLC	Agilent 1290 Infinity III LC with built-in degasser; autosampler with temperature control; thermostatted column compartment
Column	ZORBAX RRHD Eclipse XDB-C18; 80Å; 2.1 × 50 mm, 1.8 µm (p/n 981757-902)
Guard Column	ZORBAX Eclipse XDB-C18; 80Å; 2.1 mm; 1.8 µm UHPLC guard (p/n 821725-903)
Column Temperature	35 °C
Mobile Phase	A) $H_2O$ contains 5 mM ammonium acetate and 0.1% formic acid (v/v)   B) Acetonitrile
Flow Rate	0.3 mL/min
Injection Volume	2 µL
Gradient Elution Profile	Time (min)     %A     %B 0.0                 80      20 3.0                 10      90 4.0                 10      90 Post time: 1.5 min
ESI MS/MS Conditions
MS	6495D TQ with Agilent JetStream ESI (AJS)
Polarity	Positive ionization
Drying Gas Temperature	200 °C
Drying Gas Flow Rate	13 L/min
Nebulizer Gas Pressure	33 psi
Sheath Gas Temperature	350 °C
Sheath Gas Flow Rate	12 L/min
Capillary Voltage	3,000 V
Mode	Dynamic MRM MRM 1: 268 & 252 (CE: 36 V) MRM 2: 268 & 147 (CE: 30 V)

Chuẩn bị dung dịch chuẩn và đường chuẩn trên nền mẫu (Matrix-matched calibration)

Dung dịch chuẩn gốc Vàng O với nồng độ 1000 mg/L được pha từ dạng rắn của Vàng O (mã sản phẩm DRE-C16971353) sử dụng dung môi Acetonitrile. Từ đó, các dung dịch chuẩn trung gian với nồng độ 10 mg/L và 1 mg/L được pha từ dung dịch chuẩn gốc. Tất cả các dung dịch chuẩn này được bảo quản trong tủ đông sâu ở nhiệt độ -18 °C và sử dụng trong thời hạn sáu tháng.

Các dung dịch chuẩn làm việc được pha trong Acetonitrile lần lượt có nồng độ 0.5, 1, 2, 5, 10 và 50 µg/L, được tạo ra từ quá trình pha loãng các dung dịch chuẩn trung gian. Song song, các dung dịch chuẩn tương ứng nền mẫu (matrix-matched) với nồng độ 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 và 5.0 µg/L cũng được tạo ra bằng cách pha loãng theo tỉ lệ mười lần từ các dung dịch chuẩn làm việc, sử dụng dịch chiết trắng của sầu riêng.

Quy trình chuẩn bị mẫu

Hình 1 trình bày quy trình chuẩn bị mẫu nhằm phân tích chất Vàng O trong sầu riêng (bao gồm cả phần cơm và vỏ). Quy trình này bao gồm hai bước chiết xuất và làm sạch, được mô tả chi tiết hơn ở các phần dưới đây

Bước 1: Chiết mẫu

• Cân 1 gam mẫu đã đồng nhất (cơm hoặc vỏ sầu riêng) vào ống Falcon 15 mL. Thêm 5 mL acetonitrile (chứa 0.5% axit formic, HPLC grade), sau đó thêm 2 gam Natri sulfat khan.
• Lắc xoáy (Vortex) trong 1 phút, sau đó rung siêu âm (ultrasound) trong 10 phút (lặp lại bước này 2 lần).
• Ly tâm để tách mẫu và pha ACN (acetonitrile).

Bước 2: Làm sạch

• Hút 1 mL dịch nổi của mẫu chiết và thêm vào ống dSPE 2 mL chứa vật liệu làm sạch.
• Lắc xoáy (Vortex) trong 30 giây và ly tâm trong 2 phút.
• Lọc qua màng lọc (syringe membrane) nylon 0.22 µm.
• Chuyển vào lọ (vial) 2 mL và phân tích bằng hệ thống Agilent 6495D LC/TQ.

Kết quả và thảo luận

Độ nhạy và độ chọn lọc

Để đánh giá độ nhạy và độ chọn lọc của hệ thống 6495D LC/TQ trong phân tích Vàng O, tiến hành tiêm lặp lại năm lần ở nồng độ 2,5 ng/L trong nền mẫu dịch chiết từ vỏ sầu riêng. Kết quả phân tích được minh họa trong Hình 2. Trong mẫu trắng, các tín hiệu quan sát được có khả năng là nhiễu do hiện tượng đồng rửa giải do tỷ lệ ion định lượng và ion định tính chỉ đạt mức 63,5% (Hình 2A), điều này không đáp ứng các tiêu chuẩn thông thường để xác nhận kết quả sắc ký. Thêm vào đó, tỷ lệ ion giữa hai loại ion này nằm ngoài phạm vi sai số chấp nhận được đối với Vàng O, càng củng cố luận điểm rằng tín hiệu này không thuộc về chất phân tích thực sự. Cường độ của nhiễu cũng không đáng kể, với tín hiệu chỉ khoảng 60, thấp hơn nhiều so với tín hiệu của Vàng O tại nồng độ 2,5 ng/L (~330). Điều này chứng minh rằng nhiễu không có đóng góp đáng kể vào tín hiệu chính của chất phân tích.

Trong trường hợp mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 2,5 ng/L, peak Vàng O được tách biệt rõ ràng, với tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) lớn hơn 3. Kết quả này khẳng định khả năng phát hiện chính xác của hệ thống ngay cả ở mức vết và trong nền mẫu có thành phần phức tạp. Đồng thời, không ghi nhận được các tín hiệu nhiễu từ nền mẫu tại thời gian lưu của chất phân tích, phản ánh khả năng chọn lọc ưu việt nhờ vào việc tối ưu hóa các cặp ion MRM. Ngoài ra, diện tích peak thu được từ năm lần tiêm lặp lặp cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) nhỏ hơn 2%, thể hiện rõ ràng mức độ lặp lại và sự ổn định cao của thiết bị. Biên độ dao động thấp khi phân tích ở nồng độ mức ppt là minh chứng mạnh mẽ cho hiệu năng vượt trội của hệ thống 6495D LC/TQ trong các phân tích yêu cầu độ nhạy cao.

Độ tuyến tính và hiệu ứng nền

Các đường chuẩn đã được thiết lập cho cả hai nền mẫu (phần cơm và vỏ sầu riêng) thông qua việc sử dụng các chất chuẩn được xây dựng trên nền mẫu (matrix-matched standards) trong khoảng nồng độ từ 0.05 đến 5 µg/L với sáu điểm dữ liệu. Độ tuyến tính của các đường chuẩn được đánh giá dựa trên mô hình hồi quy tuyến tính, áp dụng trọng số 1/x và không đi qua gốc tọa độ. Kết quả phân tích chỉ ra rằng Vàng O đạt được mức độ tuyến tính xuất sắc, với hệ số tương quan tuyến tính R² > 0.999 trên cả hai nền mẫu, được minh họa trong Hình 3.

Hơn nữa, sự khác biệt về hiệu ứng nền giữa phần cơm và vỏ sầu riêng đã được xem xét thông qua phân tích hiệp phương sai một chiều (ANCOVA), tính toán hiệu ứng nền (Matrix Effect – ME), và việc kiểm tra các mẫu kiểm soát chất lượng (Quality Control – QC). Việc so sánh độ dốc đường chuẩn giữa hai nền mẫu đã được thực hiện bằng ANCOVA, sử dụng mô hình hồi quy β₀ + β₁x + β₂M + β₃(x × M). Kết quả cho thấy hệ số tương tác của độ dốc (slope interaction term) β₃ không có ý nghĩa thống kê (p > 0.05, với mức độ tin cậy là 95%), điều này khẳng định rằng không có sự ảnh hưởng đáng kể của nền mẫu đến tín hiệu thu nhận.

Hiệu ứng nền (ME) cũng đã được tính toán bằng cách sử dụng tỷ lệ độ dốc, như biểu diễn trong Hình 4. Các giá trị độ dốc ghi nhận lần lượt cho phần cơm và vỏ sầu riêng là 89638.95 và 89750.57. Công thức sử dụng để tính toán ME được trình bày như sau:

ME (%) = [(Slope (pulp) / Slope (husk)) – 1] × 100

Theo công thức, giá trị ME được xác định là -0.12%, nằm hoàn toàn trong giới hạn chấp nhận ±20% ^{6; 7}. Bên cạnh đó, các mẫu QC từ cả hai nền mẫu đều cho thấy độ đúng (> 95%) và độ chính xác nằm trong giới hạn chấp nhận (minh họa trong Hình 3C). Điều này xác nhận rằng đường chuẩn dựa trên nền vỏ sầu riêng có khả năng cung cấp tín hiệu phân tích tương đương với nền cơm và hoàn toàn đáng tin cậy trong việc định lượng.

Hình 4. Sắc đồ của Vàng O tại 0.05 µg/L (điểm đường chuẩn thấp nhất) trong (A) nền cơm sầu riêng and (B) vỏ sầu riêng.

Độ đúng và độ chính xác của phương pháp

Dựa trên phương pháp BJS 202204 của Trung Quốc, giới hạn định lượng (LOQ) quy định cho việc xác định Vàng O là 2 µg/kg. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, hệ thống Agilent 6495D LC/TQ với độ nhạy cao đã được sử dụng để đánh giá độ đúng của phương pháp ở các nồng độ thấp hơn đáng kể, cụ thể là 0.5 µg/kg và 2.5 µg/kg, nhằm minh chứng khả năng phân tích ổn định ở mức thấp hơn đáng kể so với ngưỡng LOQ yêu cầu. Để đánh giá độ chính xác, chất chuẩn Vàng O được thêm vào hai mức nồng độ trên trong cả hai nền mẫu vỏ và cơm sầu riêng, với tổng cộng 12 lần lặp lại (sáu lần phân tích cho mỗi mẫu). Các kết quả hiệu suất thu hồi thu được được trình bày minh họa trong Hình 5 và Bảng A1. Nhìn chung, hiệu suất thu hồi của Vàng O luôn vượt mức 70% trên cả hai loại nền mẫu. Với nền mẫu vỏ sầu riêng, tỷ lệ này dao động từ 80.0 đến 86.7% tại nồng độ 0.5 µg/kg và từ 73.0 đến 79.9% tại nồng độ 2.5 µg/kg, cho thấy sự đồng nhất cao (độ chụm tốt). Trong khi đó, nền mẫu cơm sầu riêng cho thấy sự biến thiên độ thu hồi lớn hơn nhưng vẫn nằm trong giới hạn chấp nhận được (từ 87.8 đến 104.3% ở mức 0.5 µg/kg và từ 79.6 đến 93.6% ở mức 2.5 µg/kg).

Sự giảm nhẹ trong hiệu suất thu hồi tại nồng độ 2.5 µg/kg so với 0.5 µg/kg có thể được giải thích bởi sự hiện diện của hàm lượng cao các thành phần như lipid, cellulose, lignin, protein và polyphenol trong nền mẫu cơm và vỏ sầu riêng. Khi thêm chuẩn ở nồng độ thấp, lượng nhỏ Vàng O có thể được chiết tách một cách hiệu quả. Tuy nhiên, tại nồng độ cao hơn, sự tương tác mạnh mẽ giữa Vàng O và các thành phần nền mẫu, đặc biệt là lignin và cellulose, thông qua các cơ chế tương tác π–π, lực tĩnh điện và liên kết hydro, đã làm suy giảm hiệu suất thu hồi. Là một hợp chất mang điện tích dương, Vàng O có xu hướng liên kết nhiều hơn với các cấu trúc giàu nhóm hydroxyl và phenolic trong nền mẫu, dẫn đến hiệu suất chiết tách giảm dần ở mức nồng độ cao hơn. Tuy vậy, phương pháp này vẫn đảm bảo đáp ứng đầy đủ các tiêu chí về độ chính xác và tin cậy được quy định trong Phụ lục F của AOAC, khẳng định tính khả thi và tin cậy của phương pháp phân tích định lượng này.

Hình 5: Hiệu suất thu hồi của Vàng O khi thêm chuẩn tại 0.5 và 2.5 µg/kg trong nền cơm và vỏ sầu riêng

Độ lặp lại, được biểu diễn qua độ lệch chuẩn tương đối (RSDr) trong cùng một phép phân tích với sáu lần lặp lại, dao động từ 0,90 đến 1,72% đối với cơm sầu riêng và từ 0,94 đến 1,33% đối với vỏ. Các giá trị này thấp hơn đáng kể so với ngưỡng hiệu năng được quy định trong Phụ lục F của AOAC. Đồng thời, độ tái lặp (RSD_R) – tính trên toàn bộ 12 phép đo từ cả hai phân tích viên – cũng thể hiện mức độ nhất quán cao giữa các phân tích viên, với kết quả dao động từ 2,01 đến 2,17% ở vỏ và từ 4,53 đến 6,14% ở cơm.

Nhìn chung, hiệu suất thu hồi đáng tin cậy, sai số lặp lại thấp và độ tái lặp cao đã củng cố sự chính xác và độ tin cậy của phương pháp này trong việc định lượng Vàng O ở hàm lượng vết trên các mẫu phức tạp từ sầu riêng.

Kết luận

Nghiên cứu này chứng minh hiệu suất phân tích của hệ thống LC/MS ba tứ cực Agilent 6495D, kết hợp với LC Agilent 1290 Infinity III trong việc phát hiện Vàng O trong nền mẫu sầu riêng. Thiết bị 6495D LC/TQ thể hiện độ nhạy vượt trội, cho phép phát hiện ở cấp độ ppt với độ lặp lại ổn định, nhờ công nghệ Agilent iFunnel thế hệ thứ 4, tối ưu hóa quá trình chuyển đổi ion đặc thù của hợp chất để đạt độ nhạy cao nhất. Phương pháp phân tích đã được thẩm định thêm qua các yếu tố như hiệu suất thu hồi, độ lặp lại và độ tái lặp, tất cả đều đáp ứng yêu cầu trong Phụ lục F của AOAC. Bên cạnh đó, dòng thiết bị Agilent 6400 LC/TQ series còn mang đến khả năng phân tích nhanh chóng, đáng tin cậy, giúp chúng trở thành lựa chọn hàng đầu cho việc giám sát một lượng mẫu lớn Vàng O trong nền mẫu sầu riêng.

Tài liệu tham khảo

1. IARC, Monographs Chemical agents and related occupations. 2012: Lyon, France.
2. Thailand, N. 60 tonnes of contaminated durians buried, 26 exporters banned. 2025 [cited 2025 01-12]; Available from: nationthailand.com/business/ trade/40045975?utm_source=chatgpt.com.
3. China, s.o.t.p.s.r.o., National food safety standard – Food additive – Standard for use. 2024.
4. Daily, Safety-first approach ensures export quality. 2025 [cited 2025 1-12]; Available from: https://global.chinadaily. com.cn/a/202506/30/WS6861cd2ea31000e9a5739351. html?utm_source=chatgpt.com.
5. Luo, ; et al. Determination of Auramine O and Curcumin in Durian by QuEChERS-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Food Science 2025, 46(15), 338–345.
6. AOAC, Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements. 2016.
7. SANTE, Analytical quality control and method validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed, SANTE 11312/2021.

Phụ lục

Bảng A1. Hiệu suất thu hồi của Vàng O.

Phân tích viên	Độ thu hồi (%)
	Cơm sầu riêng		Vỏ sầu riêng
	Spike 0.5 µg/kg	Spike 2.5 µg/kg	Spike 0.5 µg/kg	Spike 2.5 µg/kg
1-1	80.98	74.29	102.73	90.37
1-2	84.01	74.00	102.68	93.60
1-3	82.79	73.09	101.02	87.73
1-4	81.09	76.04	103.84	90.18
1-5	81.40	75.79	99.93	86.27
1-6	80.23	76.68	104.29	91.32
2-1	83.96	77.43	90.12	79.64
2-2	84.87	79.45	88.07	79.18
2-3	86.66	78.98	88.20	80.05
2-4	85.36	79.57	89.29	79.21
2-5	84.74	78.75	87.84	81.18
2-6	83.39	79.91	89.14	83.75